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美国红枫组织培养实例

来源:      2020-01-10 23:22:13      点击:

1、外植体处理及启动培养
1)外植体取材:当年生茎段或茎尖
2)外植体灭菌方法:用毛笔蘸肥皂水轻轻刷洗枝条。将刷洗后的枝条放入烧杯中,用流水冲洗30min左右,后转入超净工作台,移至无菌瓶中,用70%的酒精表面灭菌30s,无菌水冲洗;1%NaClO溶液灭菌2min,无菌水冲洗,再用1%NaClO溶液灭菌2min,无菌水冲洗至少3次;每次冲洗时间不少于3min。冲洗后切去植物材料与灭菌药液接触的伤口,截取1-2cm左右带节茎段或茎尖用于组织培养。
2、美国红枫的组织培养
1)启动培养
以步骤1得到的带节茎段或茎尖为外植体,将其接种于装有20ml启动培养基的200ml培养瓶中,每瓶启动培养基上接种一个茎段或茎尖,用聚丙烯塑料瓶盖封口,置于组培室中进行启动培养,组培室的条件控制在温度25℃,空气相对湿度为70%,采用日光灯照明,光照强度2800lx,光照时间为14小时/天。
经过实验筛选得到的最优的启动培养基为在MS培养基中加入6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.0mg/L,萘乙酸(NAA)0.1mg/L,30g/L绵白糖,6g/L琼脂,调节PH为6.0-6.2,在1.06kg/Cm3压力下(121℃)下灭菌15min,冷却后得到的固体培养基。
结果表明,启动培养3-5天带节茎段腋芽萌动、茎尖开始伸长,20-30天长至2cm左右,出芽率87%(出芽率=接种外植体总数-污染数-死亡数/接种总数×100%)。启动培养过程中芽的生长照片如图所示,图1为带节茎段接种30天的腋芽生长状况照片。
MS培养基成分为:大量元素:硝酸钾1900mg/L、硝酸铵1650mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、硫酸镁370mg/L、氯化钙440mg/L,微量元素:碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L,铁盐乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L,有机成分:肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L。
2)增殖培养
当步骤1)得到的外植体的腋芽或顶芽长2cm左右时取下接入装有40ml增殖培养基的200ml培养瓶中,每瓶增殖培养基上接种3-5个腋芽或顶芽,用聚丙烯塑料瓶盖封口,置于与步骤1)所述相同条件的组培室中进行增殖培养。
增殖培养基为在MS基本培养基中添加0.008mg/L塞苯隆(TDZ),30g/L绵白糖,6g/L琼脂,调节PH值至6.0-6.2,在1.06kg/Cm3压力下(121℃)下灭菌15min,冷却后得到的固体培养基。
增殖培养结果表明,增殖培养7-10天接种的腋芽或顶芽基部开始有愈伤组织出现,继续培养到15-20天在愈伤组织上可见不定芽分化,培养40天不定芽长到3-5cm,分化率为100%(分化率=分化出不定芽的腋芽及顶芽数/接种的腋芽或顶芽总数×100%),平均增殖系数为5.8(增值系数=分化的不定芽总数/接种的腋芽及顶芽总数×100%)。
3)生根培养
将步骤2得到的2cm以上的不定芽接入装有40ml生根培养基的200ml培养瓶中,每瓶生根培养基上接种3-5个不定芽,用聚丙烯塑料瓶盖封口,置于与步骤1)所述相同条件的组培室中进行生根培养。生根培养基为1/2MS基本培养基(1/2MS培养基是指MS培养基中大量元素用量减半,其它成分不变的培养基)中添加吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L,20g/L绵白糖,5g/L琼脂,调节PH值至6.0-6.2,经在1.06kg/Cm3压力下(121℃)下灭菌15min,冷却后得到的固体培养基。
生根培养4~6天在材料的基部明显可见数个颗粒状的突起,8~10天有白色根发出,培养20天后大部分材料的根可以达到3-4cm,生根率为97%(生根率=生根的不定芽数/接种的不定芽总数×100%)。生根培养20天后得到的小苗照片。
3、美国红枫小苗的炼苗移栽
3月上旬到4月中旬,将步骤2生根培养20天得到的根长至3-4cm生根苗进行炼苗,具体为从组培室中取出放置到日光充足但不直射,温度17℃—25℃,湿度50%—70%的环境中7天内逐步打开组培瓶的封口,第7天将生根苗从培养瓶中取出,20~30℃温水洗去基部残留培养基,用0.3%的KMnO4表面灭菌2min,20~30℃温水冲洗干净,用于移栽(图4中A)。
移栽具体方法如下所述:
用珍珠岩、蛭石、草炭土按照体积比为1:2:2的比例混合,作为培养基质,将上述得到的小苗栽种到该培养基质上,浇透水,置于密闭、透光的塑料小棚,棚内温度白天保持在20-30℃,夜间不低于15℃,湿度保持在60-80%,此过程中第4、5天时再浇一次透水,培养第5-7天、移栽苗的新叶开始展新叶,就开始在温度15-25℃,湿度50-70%的环境下,从两边逐步揭开塑料薄膜,3-10天内全部揭开,此时的小苗照片如图4中B所示。将小苗继续在环境温度15-25℃,湿度50-70%的条件下,培养30天(图4中C),成活率90%(成活率=成活苗数/移栽生根苗总数×100%)。每隔3-5天浇透水一次。图4中C为移栽后30天生长情况。